马铃薯是保障全球粮食和营养安全的重要作物。从野生祖先驯化过程中发生的代谢转变及其遗传机制尚不完全明确。近日，云南师范大学生命科学学院（马铃薯科学研究院）祝光涛教授团队在《Molecular Plant》期刊上在线发表了题为“Metabolomic remodeling and genetic regulation in potato tubers during domestication”的研究论文。该研究通过群体重测序，代谢组，转录组等多组学技术解析了马铃薯驯化足迹，揭示了马铃薯块茎代谢物的重塑规律与遗传基础，为马铃薯品质提升育种提供了关键理论支撑与技术靶点。

1.马铃薯地方品种的进化特征

为了确定从野生马铃薯祖先到驯化地方品种的关键进化转变，研究团队对469份材料进行全基因组重测序，包括29份野生种（, BRC）、154份野生祖先种（, BUK）、150份栽培种（, STN）和136份栽培种（, PHU）。鉴定了34,536,478个单核苷酸多态性（SNP）和21,701,658个小插入和缺失（indel）。系统发育树显示，BUK是包括STN和PHU在内的地方品种的最接近野生亲缘种，其次是外群BRC（图1B）。群体结构分析（K=2至4）显示BUK与地方品种之间存在明显的遗传组分，STN和PHU相互分离但存在遗传混杂（图1C）。主成分分析（PCA）证实了BRC、BUK和地方品种之间的遗传分化（图1D）。BUK的核苷酸多样性最高，其次是STN和PHU。固定指数（FST）显示BUK与PHU之间的分化较强，大于BUK与STN之间的分化，表明PHU是从STN演化而来，存在中度分化（图1E）。此外，BUK中的连锁不平衡（LD）衰减比地方品种中更快（图1F）。总的来说，这些基因组特征证实了地方品种是从BUK驯化而来，然后分化为STN和PHU。

图1. 马铃薯驯化和分化的基因组特征

2.驯化过程中的代谢组重塑及其遗传基础

对316份二倍体材料（102份BUK，113份STN，101份PHU）成熟块茎进行广泛靶向代谢组检测，鉴定出1,186种不同的代谢物。

PCA和PLS-DA将BUK与STN/PHU分开，这与进化基因组模式一致。地方品种中相对于BUK有187种减少和151种增加的差异积累代谢物（图2A）。下调差异代谢物为79种生物碱、22种酚酸和20种酚酰胺主导，上调主要由72种黄酮类化合物和22种酚酸主导。从STN到PHU，22种下调（例如，有机酸和黄酮醇）和217种上调（例如，生物碱、酚酸和脂质）（图2A）。为了识别代谢物的选择信号，按照先前描述的方法比较了代谢物数量遗传（QST）和中性遗传（中性FST）的分化。该比较鉴定出与驯化相关和与分化相关差异代谢物，分别与这些差异代谢物有89.34%和85.35%的重叠（图2B-C）。驯化驱动的选择显著降低了驯化块茎中生物碱、酚酰胺和酚酸含量（图2D）。同时，从BUK到地方品种，黄酮类化合物显著增加。基于代谢物的全基因组关联分析（mGWAS），鉴定出2,046个显著位点，包含2,493个lead SNP，与568种代谢物相关联（图2E），有23个热点区域，主要位于染色体（chr）10、4、1、5和7上（图2F）。chr07上的热点11主要与26种SGAs相关，chr10上的热点16与66种黄酮类化合物和18种酚酸相关。总的来说，该数据集为分析代谢物变异的遗传基础提供了一个框架。

图2. 块茎薯肉中与驯化相关的代谢物改变及其遗传基础

3.两个生物合成基因的编码变异调控SGAs的结构分化

SGAs作为植物防御化合物，但由于其毒性和苦味，对人类而言是抗营养因子。在鉴定出的81种SGAs中，16种螺甾烷型和9种四糖型SGAs在BUK材料中高度积累，地方品种中几乎不存在（图3A）。一个位点（chr01:2,456,132）与螺甾烷型SGAs相关联（mt0830，图3B）。确定马铃薯茄啶合成双加氧酶（DPS）是调控螺甾烷和茄啶骨架分化的因果基因（图3C）。高螺甾烷型SGA含量BUK材料中DPS被截短，从而阻止了茄啶的生物合成。

九种三糖型和四种四糖型SGAs定位到chr07上（图3D-E）。一个lead indel（chr07:44,169,201）与α-茄碱和垂茄碱的含量呈负相关（图3F）。候选基因分析显示在该indel附近鉴定出一个截短的玉米素-O-葡萄糖基转移酶（ZOG）（图3G）。ZOG的表达与垂茄碱含量呈正相关，与α-茄碱含量呈负相关（图3H）。栽培材料（01-58）中过表达全长ZOG显著提高了叶片中两种四糖型SGAs的含量（图3I）。体外实验证实，ZOG催化γ-卡茄碱的糖基化，产生茄啶-glc-glc和茄啶-glc-xyl（图3J）。基因分型显示，地方品种ZOG基因被截短，表明在驯化过程中对功能性ZOG进行了强烈的负向选择，使得地方品种中保留了无效等位基因。

图3. 马铃薯驯化过程中SGA结构多样性的减少

4.鉴定GAME9作为调控SGA生物合成的关键驯化基因

块茎薯肉中，SGA水平降低是一个关键的驯化性状。作者利用BUK材料和一个近交STN系开发了BC1群体（图4A-C），进行BSA分析，鉴定出一个QTL，qSGA1，位于chr01: 70.90-71.40 Mb区间（图4D），该区间包含六个乙烯响应因子（ERF）基因（图4E）。在这些基因中，GAME9的表达与α-卡茄碱（图4F）和α-茄碱（图4G）强烈相关，地方品种块茎中的表达量比野生型降低了93%（图4H）。启动子替换转基因实验，显示BUK材料（Hap1）的GAME9启动子驱动的表达水平比栽培材料启动子（Hap2）高39.62倍，并导致块茎薯肉中SGA积累量高4.65倍（图4I-J）。序列分析鉴定出两个单倍型启动子区域存在60个SNP和8个indel差异（图4K）。烟草叶片中瞬时表达实验显示，与Hap2片段相比，Hap1片段（2.0 kb和1.0 kb）的荧光素酶活性高出4.29倍以上（图4L）。0.5-1.0 kb区域的三个SNP的频率从BUK的62%转变为地方品种的1%（图4M）。对这三个候选SNP的多重诱变分析证实，它们通过瞬时表达在烟草叶片中降低了Hap1的荧光素酶活性，同时增加了Hap2的荧光素酶活性（图4N）。

群体遗传分析显示，GAME9上游0.5-1.0 kb区域的核苷酸多样性降低了39.4倍（图4O）。这些数据共同表明，GAME9启动子在驯化过程中经历了强烈的选择。

图4. GAME9的负选择降低了栽培块茎中的SGA含量

5.鉴定一个调控SGA生物合成的新型转录因子

对94份材料（53份BUK和41份地方品种）块茎进行转录组测序。WGCNA分析显示，模块14中的MYB13与GAME9和24个生物合成基因相关联（图5A），并且与一些SGAs显著相关。MYB13过表达株系（MYB13-OE）在块茎中呈现735个上调基因和254个下调基因。共有12个SGA生物合成基因被上调（图5B），代谢组分析证实OE株系中有41种SGAs含量升高。具体来说，α-卡茄碱和α-茄碱的含量相对于野生型（WT）增加了约16-25倍（图5C），突出了MYB13在SGA生物合成中的正向调控作用。

DNA亲和纯化测序（DAP-seq）在9732个基因中鉴定出11,114个信号峰，并发现了一个保守的MYB结合基序ACC(A/T)A(A/C)。与转录组数据整合揭示了106个直接靶标，包括GAME12。酵母单杂交（Y1H）、双荧光素酶报告基因（LUC）分析和电泳迁移率变动（EMSA）分析证实MYB13通过ACCTA基序结合到GAME12启动子（图5E-H）。MYB13过表达不影响GAME9的表达，并且MYB13的表达不受GAME9激活。这些数据表明MYB13是一个新型的转录激活因子，能够直接结合GAME12，在转录水平上独立于GAME9发挥作用。块茎中MYB13在BUK中表达比地方品种高3.67倍。该表达与位于MYB13起始密码子上游128 bp的一个SNP（chr06:59,018,787）显著相关。与高表达相关的AA基因型在地方品种中较少见。这些结果表明顺式调控变异很可能是导致表达变化的原因，并且它在驯化过程中受到了选择。

图5. MYB13直接调控块茎中的SGA生物合成

6.一个MYB基因簇调控苯丙烷代谢流的重定向

苯丙烷类化合物，包括酚酸和黄酮类化合物，对风味和人体营养至关重要。总共有38种黄酮类化合物和5种酚酸定位到热点16（chr10: 53,909,132，图6A），该区域包含8个串联成簇的MYB转录因子（图6B）。其中五个成员在块茎中有表达，MYB200和MYB210与代谢物水平呈正相关（图6C）。与BUK相比，地方品种中MYB210的表达上调了755.38倍（图6D），这与地方品种中黄酮类化合物高积累一致。myb200敲除（KO）降低了10种黄酮类化合物的含量，增加了56种酚酸的含量（图6E-F）。myb210-KO降低了5种黄酮类化合物的含量，增加了16种酚酸的含量（图6G）。转录组分析显示，myb200-KO下调了MYB210和两个黄酮类生物合成基因（CHI和F3H）的表达，上调了六个酚酸生物合成基因（C3H, CCR和四个CCoAOMT；图6H）的表达。myb210-KO特异性上调了两个CCoAOMT的表达（图6H）。这些结果确立了MYB200和MYB210作为苯丙烷生物合成的关键调节因子，特别是在块茎薯肉中将代谢流从酚酸途径转向黄酮类化合物途径。

该黄酮类位点与控制块茎着色的色素块茎薯肉/抑制因子（Pf/I）位点共定位。结构变异（SV）分析鉴定出在MYB210上游34 bp处存在一个1,758bp的缺失（图6I）。纯合缺失等位基因（-/-）显著降低了MYB210的表达和黄酮类化合物的积累（例如mt1186；图6J）。野生型等位基因（+）存在于55%的地方品种中（图6K），并且与块茎着色频率增加相关（从BUK的5.55%到地方品种的67.59%）。考虑到黄酮类化合物和花青素共享调控途径，这些发现表明早期农民可能选择了有色块茎，无意中通过MYB200/MYB210介导的代谢重编程增强了黄酮类化合物的积累。

图6.驯化过程中由 MYB 蛋白调控的苯丙素代谢重定向马铃薯代谢性状优化的遗传路线图

研究通过mGWAS，鉴定出2046个与568种代谢物相关的遗传位点，构建了覆盖单效应、上位性、多效性的马铃薯代谢优化遗传图谱。（图7A）。抗氧化剂核黄素（mt0728），其位于chr02:39,636,369的位点解释了12.48%的变异，纯合C等位基因的含量增加了4.43倍（图7B）。致癌物丙烯酰胺前体物质L-天冬酰胺（mt0203），chr01:85,114,866位点的T等位基因使L-天冬酰胺含量相对于C等位基因降低了63%（图7C）。这些单等位基因靶点为育种带来了显著的遗传改良效果。此外，307 种代谢物与 1246 个加性效应位点相关，还有 138 种代谢物受到上位性影响（2745 个位点对，图 7D）。协同等位基因组合代表了优化策略。调控抗氧化剂6-O-咖啡酰熊果苷（mt0883）的两个上位性位点显示，chr07:47,569,451的A等位基因与chr10:53,957,276的A等位基因结合时，其效应显著增强（图7E）。AA-AA基因型的含量比GG-GG基因型高出375.85倍。该策略也适用于营养目标，例如L-高蛋氨酸（mt0089）。将chr09:61,189,535的T等位基因和chr10:3,511,213的C等位基因组合成TT-CC基因型，其含量比GG-TT基因型高出51.70倍，优于GG-CC和TT-TT的加性组合（图7F）。

268个位点观察到多效性效应。一些共定位的代谢物处于同一生物合成途径中，例如，chr11:41,592,750（PVE为5.92-9.62%）与一种花青素和五种黄酮醇共定位，该位点与编码黄酮3',5'-羟化酶的紫色（Purple）位点重叠。A/A缺失等位基因诱导的含量比ATC/ATC等位基因高7.65-74.96倍（图7G）。其他多效性位点调控不同的代谢物类别，例如，chr06:13,776,090（PVE为7.36-16.75%）与九种代谢物相关，涵盖有机酸、酚酸、糖类和醇类。T等位基因使七种代谢物增加了1.11-2.28倍，但使奎宁酸（mt0224）减少了30%（图7H），表明其代谢改变背后存在复杂的调控网络。总的来说，整合PVE、等位基因效应、遗传相互作用和多效性，能够构建一个用于马铃薯代谢改良的多组学图谱。

图7.优化块茎代谢性状的多组学图谱

本研究采用多组学方法解析马铃薯驯化特征，发现块茎代谢重塑主要体现在苦味甾体糖生物碱（SGAs）多样性与含量降低，以及营养类黄酮含量增加。研究鉴定了两个影响SGA结构分化的生物合成基因和两个调控SGA含量的转录因子，并证明两个串联MYB转录因子可调控苯丙烷代谢流在酚酸与类黄酮之间的分配。研究结果表明，编码区与顺式调控区的变异选择分别显著重塑了块茎代谢物的多样性与含量。通过对568种代谢物涉及的2,046个位点（包含2,745个上位性互作与268个多效性效应）进行遗传架构解析，为块茎代谢调控提供了路线图。这些发现深化了我们对马铃薯驯化的理解，并为培育优质品种提供了遗传策略。